善熠（苏州）细胞生物科技有限公司

     目前，以北美萤火虫（Photinus pyralis）来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个62kDa的单体酶，无需表达后修饰，直接具有可被检测的酶活。

2.2 海肾荧光素酶

     此外，提取自海洋腔肠动物海肾（Renilla reniformis）的荧光素酶也是一种可以催化荧光素发生荧光反应的单亚基特异活性蛋白，其分子量为36kDa。同萤火虫荧光素酶一样，该蛋白质在完成转录翻译后即具有催化活性。海肾荧光素酶只需要氧气就可以催化腔肠素氧化产生蓝光，波长460-540nm，一般检测时选用460nm

2.3 高斯荧光素酶

      Gaussia荧光素酶，这是一种分泌型的蓝色荧光素酶，蛋白分子量更小，只有22KD，含有天然的分泌型信号肽，可以引导荧光素酶分泌到细胞培养上清中，从而无需裂解细胞即可检测报告基因活性。所表达的荧光素酶85%以上都会分泌至胞外，不过由于这种分泌型荧光素酶产生的信号比来自Firefly（萤火虫）或Renilla（海肾）的信号强很多倍，所以还可以在细胞裂解物中检测到细胞内残留的荧光素酶。分泌表达为检测带来很大的方便——不需要裂解珍贵的细胞，即可作活细胞实时动力学分析，连续时间曲线研究。可与红色萤火虫荧光素酶组合为双色检测系统。

2.4 海萤荧光素酶

     Cypridina（海萤）荧光素酶也是一种分泌型荧光素酶，呈美丽的蓝紫色，蛋白分子量大小有62KD。同Gaussia一样，大部分荧光素酶产物会分泌到胞外，可对活细胞实施连续检测，非常方便。由于信号很强，细胞内残留的荧光素酶还足以进行常规的裂解细胞检测，可实现多重检测。Cypridina（海萤）荧光素酶可与红色萤火虫荧光素酶组合为双色检测。

     萤火虫荧光素酶在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下，催化荧光素氧化，生成氧化荧光素，同时产生黄绿色光，波长540-600nm。通过其反应原理可以根据发光强度直接测量ATP含量，直接检测细胞活性与细胞增殖状态。还可间接应用于药物毒性分析、药敏和药物筛选以及检测胞外ATP反应细胞炎症状态。检测环境中的ATP含量还可以作为检测微生物含量的研究手段。

3.2 作为报告基因研究基因表达与蛋白互作

      将萤火虫荧光素酶蛋白分成大小两个片段，分别连接两个待测目标蛋白，当两个目标蛋白相互作用时，荧光素酶的两个片段在空间上靠近并重新组合成完整的荧光素酶，从而催化荧光素产生荧光。

荧光共振能量转移实验

      当两个蛋白分子相互作用，一个蛋白融合表达的供体萤光素酶蛋白(传统使用Renilla海肾萤光素酶)酶学反应产生的的发光信号光 谱与另一个蛋白标记的受体荧光基团的激发光谱相重叠，诱发受体分子发出荧光。

miRNA与靶基因的靶向互作研究

      MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA。一个miRNA可以靶向不同基因进行调节，同时同一个基因也可以被好几个miRNAs靶向。miRNA可以与编码基因mRNA的3’UTR结合也可以直接与circRNA或lncRNA结合来调控相关基因的表达。

      将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入对应的miRNA，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列，同理，这也可用于验证miRNA同lncRNA之间的靶向互作

启动子结构分析

       目前，对启动子的分析重点大多集中于对启动子中各调控元件，即各种转录因子的DNA识别/结合位点，这些元件通常较为保守，长度较短，从几个碱基到十几个碱基不等。

       通过截断式检测，逐步缺失远端序列（因为核心启动子位于靠近TSS端，缺失该处会丧失基本转录活性）；适用于确定启动子核心区域或转录因子与启动子预测结合位点较多且评分相近，需要进一步缩小范围的情况。（携带目的启动子的报告载体promoter、不携带目的启动子的报告载体promoter-空载），一般选取目的基因上游总长为2000bp碱基作为目标基因的启动子序列

转录因子与启动子调控机制研究

       转录因子（Transcription factor，TF）是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子，可与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对基因的转录有激活或抑制作用。一些转录因子仅与其靶基因启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。双荧光素酶报告基因实验是检测这类转录因子和其靶基因启动子中的特异顺式元件结合的重要手段。

       将启动子区域插入双荧光素酶报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达对应的转录因子，可分析转录因子过表达是否提高或降低荧光素酶活性

       转录因子结合至启动子区域，并改变其启动子功能的强弱，便可引起下游报告基因Fluc转录水平发生变化，进而影响其蛋白翻译，最终底物与荧光素酶反应发生变化，荧光强弱发生改变，最终达成互作功能验证。

启动子活性分析

       启动子（Promoter）是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，可活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确结合并具有转录起始的特异性，是基因的重要组成部分，其主要功能为调控基因表达（转录）的起始时间和表达程度。启动子的表达模式及强度可通过双荧光报告基因实验来检测。

       报告基因是当前启动子功能研究最为广泛的方法。将待测启动子构建至荧光素酶基因的上游，检测启动子的活性。

3.3 动物活体成像与细胞定位

动物成像

       哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。

       基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。标记细胞的方法基本上是通过分子生物学克隆技术, 将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选, 培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。将标记好的细胞注入小鼠体内后, 观测前需要注射荧光素酶的底物—荧光素，大小约280道尔顿。荧光素脂溶性非常好, 很容易透过血脑屏障。注射一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30-45分钟。

用荧光素酶标记干细胞有以下几种方法：一种是标记组成性表达的基因，做成转基因动物，

细胞定位

       在干细胞研究中，通过两种方法用荧光素酶标记干细胞：一种是标记组成性表达的基因，做成转基因动物，干细胞就被标记了，若干细胞移植到另外动物体内，可以用活体生物发光成像技术示踪干细胞在体内的增殖、分化及迁徙的过程；另外一种方法是用慢病毒直接标记干细胞后，移植到体内观测其增殖、分化及迁徙过程，研究其修复、治疗损伤或缺陷部分的效果，进一步探讨其机制。

药效评估

       在药效学评价方面，荧光素酶癌症模型可用于癌症体内用药在整体动物水平上进行长期疗效跟踪观察。利用无创伤活体成像对癌细胞生长的检测，可对癌症治疗之前和过程中的癌细胞的变化进行实时观测和评估。这种方式提供一个很好的对癌细胞的反应和复发评估的预诊断途径。用活体成像的方法比传统技术有更高的灵敏度，当用传统的方法还不能检测到瘤块时，用该技术已经可以检测到很强的信号。由于该技术只是检测活细胞，不能检测已经凋亡的细胞。而用传统的方法，不能区别正常细胞与凋亡的细胞，所以该技术可以比传统技术更早更灵敏的发现药物的疗效。利用活体成像技术高灵敏度、观察方便的特点，在抗肿瘤药物临床前研究中，通过给予肿瘤接种的小鼠不同剂量，不同给药时间、不同给药途径，观察抗肿瘤药物的最佳给药途径、给药剂量及给药时间，从而制定合适的剂型与服药时间。